Genom kura-kura raksasa memberikan wawasan umur panjang dan penyakit terkait usia

Genom kura-kura raksasa memberikan wawasan umur panjang dan penyakit terkait usia

Abstrak

Kura-kura raksasa adalah salah satu dari hewan vertebrata berumur panjang dan, dengan demikian, memberikan model yang sangat baik untuk mempelajari sifat-sifat seperti umur panjang dan penyakit yang berkaitan dengan usia. Namun, informasi evolusi genomik dan molekuler tentang kura-kura raksasa sangat langka. Di sini, kami menggambarkan analisis global genom Lonesome George — anggota terakhir ikon Chelonoidis abingdonii — dan kura-kura raksasa Aldabra (Aldabrachelys gigantea). Perbandingan genom ini dengan spesies terkait, menggunakan analisis yang tidak diawasi dan diawasi, mengarahkan kami untuk mendeteksi varian spesifik garis keturunan yang memengaruhi gen perbaikan DNA, mediator inflamasi, dan gen yang terkait dengan perkembangan kanker. Studi kami juga memberi petunjuk tentang strategi evolusi spesifik yang dikaitkan dengan peningkatan umur, dan memperluas pemahaman kita tentang faktor penentu genomik penuaan. Urutan genom baru ini juga menyediakan sumber daya penting untuk membantu upaya restorasi populasi kura-kura raksasa.

Utama

Analisis genom komparatif memanfaatkan mekanisme seleksi alam untuk menemukan gen dan jalur biokimia yang terkait dengan sifat dan proses yang kompleks. Banyak karya telah menggunakan teknik ini dengan genom mamalia berumur panjang untuk menjelaskan jaringan pensinyalan dan metabolisme yang mungkin berperan dalam mengatur kondisi yang berkaitan dengan usia1,2. Studi serupa pada organisme umur panjang yang tidak terkait mungkin mengungkap strategi evolusi baru dan penentu genetik penuaan di lingkungan yang berbeda. Dalam hal ini, kura-kura raksasa merupakan salah satu dari sedikit kelompok vertebrata dengan umur panjang yang luar biasa: lebih dari 100 tahun menurut beberapa perkiraan.

Dalam naskah ini, kami melaporkan sekuensing genom dan analisis genom komparatif dari dua kura-kura raksasa berumur panjang: Lonesome George — perwakilan terakhir Chelonoidis abingdonii3, endemik di pulau Pinta (Kepulauan Galapagos, Ekuador) —dan seorang individu dari Aldabrachelys gigantea , endemik ke Aldabra Atoll dan satu-satunya spesies kura-kura raksasa yang masih ada di Samudra Hindia4 (Gbr. 1a). Analisis komparatif yang tidak diawasi dan diawasi dari sekuens genom ini menambah informasi genetik baru tentang evolusi kura-kura, dan menyediakan gen kandidat baru yang mungkin mendasari karakteristik luar biasa dari kura-kura raksasa, termasuk gigantisme dan umur panjang mereka.

hasil dan Diskusi

Genom Lonesome George diurutkan menggunakan kombinasi platform Illumina dan PacBio (Bagian Tambahan 1.1). Genom rakitan (CheloAbing 1.0) memiliki ukuran genom 2,3 gigabase dan berisi 10.623 perancah dengan N50 sebesar 1,27 megabase (Bagian Tambahan 1.1 dan Tabel Tambahan 1-3). Kami juga mengurutkan, dengan platform Illumina, kura-kura A. gigantea yang memiliki kaitan erat dengan kedalaman pembacaan rata-rata 28 ×. Urutan genom ini selaras dengan CheloAbing 1.0.

Perkiraan database TimeTree menunjukkan bahwa kura-kura raksasa Galapagos dan Aldabra memiliki nenek moyang yang sama sekitar 40 juta tahun yang lalu, sementara keduanya menyimpang dari garis keturunan manusia lebih dari 300 juta tahun yang lalu (Bagian Tambahan 1.4) . Analisis awal sejarah demografi menggunakan model berpasangan Markovian coalescent (PSMC) 5 secara berpasangan menunjukkan bahwa sementara ukuran populasi efektif C. abingdonii telah terus menurun selama jutaan tahun terakhir, dengan sedikit peningkatan sekitar 90.000 tahun yang lalu, populasi Kura-kura Aldabra raksasa mengalami fluktuasi substansial selama periode ini (Gbr. 1b). Rekonstruksi ukuran populasi yang efektif untuk C. abingdonii kehilangan kekuatan statistik pada jangka waktu jutaan tahun, mungkin karena penyatuan yang lengkap. Pada gilirannya, ini menunjukkan bahwa keragaman keseluruhan dalam kura-kura raksasa ini pasti rendah selama beberapa generasi. Bersama-sama, hasil ini mendorong kami untuk mengusulkan bahwa populasi kura-kura raksasa insular ini rentan pada saat ditemukannya manusia di Kepulauan Galapagos, mungkin meningkatkan risiko kepunahan mereka.

Menggunakan pencarian homologi dengan set gen yang diketahui dari manusia dan Pelodiscus sinensis (kura-kura kerang Cina), bersama dengan data sequencing RNA (RNA-Seq) dari darah C. abingdonii dan granuloma A. gigantea, kami secara otomatis meramalkan serangkaian primer dari 27.208 gen dari rakitan genom menggunakan algoritma MAKER26. Kami kemudian melakukan penyelarasan berpasangan antara masing-masing urutan protein yang diprediksi primer dan database UniProt untuk manusia dan P. sinensis, yang urutan beranotasinya menunjukkan kualitas yang relatif tinggi jika dibandingkan dengan data yang tersedia untuk kura-kura lain7. Menggunakan keberpihakan yang mencakup setidaknya 80% dari protein terpanjang dan menunjukkan lebih dari 60% identitas, kami membangun serangkaian keluarga protein yang dibagi di antara spesies ini. Analisis pendahuluan ini memilih beberapa keluarga protein yang tampaknya telah mengalami ekspansi moderat pada leluhur bersama C. abingdonii dan A. gigantea. Hampir semua ekspansi ini juga dikonfirmasi dalam genom kura-kura Gopherus agassizii yang telah berumur panjang (Bagian Tambahan 1.2 dan Tabel Tambahan 4). Sebagian besar gen ini telah dikaitkan dengan pembentukan exosome, menunjukkan bahwa proses ini mungkin penting dalam evolusi kura-kura.

Kami juga menginterogasi gen yang diprediksi untuk bukti seleksi positif pada kura-kura raksasa. Analisis ini memilih 43 gen dengan bukti seleksi positif spesifik-kura-kura raksasa (Bagian Tambahan 1.2, Tabel Tambahan 5 dan Gambar Tambahan 1). Daftar ini mencakup gen dengan peran yang diketahui dalam dinamika sitoskeleton tubulin (TUBE1 dan TUBG1) dan perdagangan vesikel intraseluler (VPS35). Yang penting, analisis gen yang menunjukkan bukti seleksi positif juga termasuk AHSG dan FGF19, yang tingkat ekspresinya telah dikaitkan dengan keberhasilan penuaan pada manusia8. Peran kedua faktor dalam regulasi metabolisme9,10 — ciri khas lain dari usia11,12 — menunjukkan bahwa perubahan spesifik yang diamati pada protein ini mungkin muncul untuk mengakomodasi tantangan yang diajukan umur panjang pada sistem ini. Daftar gen dengan tanda-tanda seleksi positif juga menampilkan TDO2, yang penghambatannya telah diusulkan untuk melindungi terhadap penyakit terkait usia melalui regulasi proteostasis yang dimediasi triptofan13. Selain itu, kami menemukan bukti untuk seleksi positif yang mempengaruhi beberapa gen yang terlibat dalam modulasi sistem kekebalan tubuh, seperti MVK, IRAK1BP1 dan IL1R2. Secara bersama-sama, hasil ini mengidentifikasi proteostasis, regulasi metabolisme, dan respons imun sebagai proses utama selama evolusi kura-kura raksasa melalui efek pada umur panjang dan resistensi terhadap infeksi.

Sejalan dengan analisis otomatis ini, kami menggunakan anotasi yang diawasi secara manual pada lebih dari 3.000 gen yang dipilih apriori untuk serangkaian studi berbasis hipotesis pada pengembangan, fisiologi, imunitas, metabolisme, respons stres, kerentanan kanker dan umur panjang (Bagian Tambahan 1.3 dan Gambar Tambahan) 2). Kami mencari varian pemotongan, varian yang memengaruhi motif dan varian yang diketahui yang memiliki hubungan manusia dengan penyakit genetik yang diketahui (Bagian Tambahan 1.3 dan Tabel Tambahan 6). Varian ini pertama kali dikonfirmasi dengan data RNA-Seq. Kemudian, lebih dari 100 varian yang paling menarik dalam hal relevansi fungsional diduga juga divalidasi oleh amplifikasi PCR diikuti oleh Sanger sequencing. Untuk tujuan ini, kami menggunakan panel sampel DNA genom dari 11 spesies berbeda dari kura-kura raksasa endemik ke pulau yang berbeda dari Kepulauan Galapagos (Bagian Tambahan 1, Tabel Tambahan 7 dan Gambar Tambahan 3.).

Anotasi gen yang berkaitan dengan perkembangan yang diawasi secara manual menunjukkan konservasi lengkap dari gen Hox yang ditetapkan di antara kura-kura raksasa, dengan pengecualian HOXC3, yang tampaknya telah hilang dalam radiasi Archelosauria14,15 (Bagian Tambahan 2, Tambahan Tabel 8 dan Gambar Tambahan 4). Keluarga gen BMP dan GDF juga ditemukan dilestarikan, meskipun peristiwa duplikasi yang memunculkan GDF1 dan GDF3 pada mamalia tidak terjadi pada kura-kura, burung, dan buaya. Sebaliknya, kami menemukan duplikasi gen ParaHox CDX4 pada kura-kura raksasa, juga terdapat pada reptil lain serta reptil unggas (burung). Anotasi ini juga menunjukkan duplikasi WNT11 pada kura-kura dan ayam (tetapi tidak pada kadal Anolis carolinensis), dan duplikasi spesifik WNT4 pada kura-kura. Mengingat peran gen yang digandakan ini dan pelestariannya pada sebagian besar spesies vertebrata, mereka dapat membuktikan menjadi kandidat yang berguna untuk mempelajari perkembangan morfologi penyu, terutama dalam kaitannya dengan pembentukan cangkang. Sebagai catatan, KDSR — salah satu gen yang kemungkinan diseleksi positif pada kura-kura raksasa — telah dikaitkan dengan gangguan hiperkeratinisasi16. Juga, dalam hal ini, kami mencatat 30 β-keratin dalam C. abingdonii, 26 di antaranya tampaknya fungsional. Angka-angka ini lebih rendah dari yang dilaporkan sebelumnya untuk β-keratin pada kura-kura lain17. Akhirnya, kami tidak menemukan dalam C. abingdonii atau A. gigantea setiap ortholog fungsional dari gen yang secara khusus terlibat dalam perkembangan gigi (seperti ENAM, AMEL, AMBN, DSPP, KLK4 dan MMP20). Temuan ini menegaskan pola dalam mekanisme molekuler evolusioner untuk kehilangan gigi, yang tampaknya telah diikuti secara konsisten dan independen di seluruh vertebrata. Secara bersama-sama, hasil ini menawarkan banyak kandidat untuk mempelajari sifat-sifat perkembangan dalam kura-kura (Bagian Tambahan 2 dan Gambar Tambahan. 5-8).

Pada sebagian besar spesies, fungsi kekebalan adalah pendorong evolusi yang berada di bawah tekanan selektif yang kuat dan memiliki implikasi penting dalam penuaan dan penyakit18. Komponen spesifik dan fungsionalitas komponen sistem kekebalan di Reptilia, bagaimanapun, belum dikarakterisasi secara luas di luar kompleks histokompatibilitas utama (MHC) 19,20. Analisis terperinci kami terhadap 891 gen yang terlibat dalam fungsi kekebalan secara konsisten menemukan duplikasi yang memengaruhi gen kekebalan pada kura-kura raksasa dibandingkan dengan mamalia (Bagian Tambahan 3, Tabel Tambahan 9 dan Gambar Tambahan. 9-13). Kami menemukan ekspansi genom PRF1 (encoding perforin) pada kura-kura raksasa dan kura-kura lainnya, dibandingkan dengan ayam (satu salinan), A. carolinensis (dua salinan) dan sebagian besar mamalia (satu salinan). Baik C. abingdonii dan A. gigantea memiliki 12 salinan gen ini (divalidasi oleh sekuensing Sanger), meskipun tiga dari mereka telah di-pseudogenisasi dalam C. abingdonii. Selain itu, kami mendeteksi dan memvalidasi, dengan pengurutan Sanger, perluasan lokus chymase, yang mengandung granzymes, pada kura-kura raksasa (Bagian Tambahan 3.1 dan Gambar Tambahan. 10). Kedua ekspansi ini diharapkan mempengaruhi fungsi limfosit T sitotoksik dan fungsi pembunuh alami, yang memainkan peran penting dalam pertahanan melawan patogen dan kanker21,22. Ekspansi bersamaan lainnya melibatkan gen APOBEC1, CAMP, CHIA dan NLRP, yang berpartisipasi dalam pertahanan virus, mikroba, jamur dan parasit. Hasil ini menunjukkan bahwa sistem kekebalan tubuh bawaan pada kura-kura, dan terutama pada kura-kura raksasa, mungkin memainkan peran yang lebih relevan daripada pada mamalia, konsisten dengan peran yang kurang penting yang dimainkan oleh kekebalan adaptif19. Kami menemukan bahwa gen MHC kelas I dan II mungkin mengalami peristiwa duplikasi pada nenek moyang yang sama antara kura-kura raksasa dan kura-kura lukis (Chrysemys picta bellii). Kami juga mencatat 40 gen MHC kelas III, sehingga mengkonfirmasi konservasi gugus ini dalam kura-kura raksasa. Sejumlah besar gen MHC dalam kura-kura raksasa konsisten dengan saran bahwa nenek moyang archosaurs dan chelonians tidak memiliki MHC esensial minimal seperti yang ditemukan dalam genome ayam20 (Bagian Tambahan 3.3, Tabel Tambahan 10 dan Gambar Tambahan. 14-16).

Kura-kura raksasa berada di ujung atas skala ukuran untuk Chelonii yang masih ada, dan sering digunakan sebagai contoh gigantisme23. Kami menganalisis serangkaian gen yang terlibat dalam regulasi ukuran pada vertebrata, terutama anjing (Bagian Tambahan 2, Tabel Tambahan 8 dan Gambar Tambahan. 6). Hasil kami pada gen yang terkait dengan hormon pertumbuhan, sistem faktor pertumbuhan (IGF) insulin dan stanniocalcins menunjukkan bahwa gen ini terlestarikan dengan baik; Oleh karena itu, penentu ukuran tambahan mungkin ada di kura-kura raksasa. Sebagai fenotip yang kompleks, gigantisme pada kura-kura diperkirakan disebabkan oleh interaksi antara berbagai faktor genetik dan lingkungan. Temuan yang menarik dalam hal ini adalah adanya beberapa varian gen dalam kura-kura (termasuk G. agassizii) yang mungkin memengaruhi aktivitas gen metabolisme glukosa, seperti MIF (hal. N111C; diharapkan menghasilkan trimer yang terkunci) dan GSK3A (hal. R272Q dalam loop aktivasi). Mengingat peran posisi-posisi ini dalam ortolog mamalia dari gen-gen ini, perubahan spesifik kura-kura dapat menunjukkan perbedaan dalam pengaturan asupan glukosa dan toleransi (Bagian Tambahan 4, Tabel Tambahan 11, dan Gambar Tambahan 17 dan 18). Kami juga menemukan ekspansi dan inaktivasi pada gen lain yang terlibat dalam metabolisme energi. Jadi, gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) —sebuah enzim glikolitik dengan peran kunci dalam produksi energi, serta dalam perbaikan DNA dan apoptosis24 — diperluas dalam kura-kura raksasa. Sebaliknya, gen NLN yang mengkode neurolysin di-pseudogenisasi dalam kura-kura. Hilangnya gen ini pada tikus telah dikaitkan dengan peningkatan penyerapan glukosa dan sensitivitas insulin25. Secara keseluruhan, hasil ini mengarahkan kami untuk berhipotesis bahwa varian genom yang mempengaruhi metabolisme glukosa mungkin menjadi faktor dalam pengembangan kura-kura.

Analisis gen yang terkait dengan respons stres juga menyoroti beberapa varian diduga pada kura-kura raksasa yang memengaruhi globin dan faktor perbaikan DNA (Bagian Tambahan 5, Tabel Tambahan 12 dan 13, dan Gambar Tambahan. 19-22, 32 dan 33). Kami menemukan bahwa, meski hidup di bumi, kura-kura raksasa melestarikan globin GbX26 yang terkait dengan hipoksia. Bersama dengan coelacanth, kura-kura, termasuk kura-kura raksasa, adalah satu-satunya organisme yang diketahui memiliki kedelapan jenis globins27. Konsisten dengan ini, kami menemukan di kedua genom kura-kura raksasa varian dalam faktor transkripsi TP53 (hal.106E) yang telah dikaitkan dengan resistensi hipoksia pada beberapa mamalia dan ikan28. Kehadiran residu yang sama di Testudines sangat menyarankan proses evolusi konvergen dalam adaptasi terhadap hipoksia, mungkin didorong oleh lingkungan akuatik leluhur, yang meninggalkan jejak ini dalam genom kura-kura darat raksasa.

Ciri penting vertebrata yang besar dan berumur panjang adalah kebutuhan mereka akan mekanisme perlindungan kanker yang lebih ketat, seperti yang diilustrasikan oleh paradoks Peto29,30. Pada gilirannya, kebutuhan akan perlindungan tambahan ini menggambarkan hubungan mendalam dan saling ketergantungan antara kanker dan umur panjang (Gbr. 2). Khususnya, tumor diyakini sangat langka pada kura-kura31. Oleh karena itu, kami menganalisis lebih dari 400 gen yang diklasifikasikan dalam sensus gen kanker yang mapan sebagai onkogen dan penekan tumor32. Meskipun sebagian besar menunjukkan sekuens asam amino yang sangat terkonservasi bila dibandingkan dengan sekuens organisme lain, kami menemukan perubahan pada beberapa gen yang berhubungan dengan tumourigenesis (Gambar 2a, Bagian Tambahan 6, Tabel Tambahan 14 dan Gambar Tambahan. 23-29). Pertama, kami menemukan bahwa beberapa penekan tumor diduga diperluas dalam penyu dibandingkan dengan vertebrata lainnya, termasuk duplikasi di SMAD4, NF2, PML, PTPN11 dan P2RY8. Selain itu, perluasan PRF1 yang disebutkan di atas, bersama dengan duplikasi kura-kura khusus dari PRDM1, menunjukkan bahwa pengawasan imunosurve dapat ditingkatkan pada kura-kura. Demikian juga, kami menemukan duplikasi spesifik kura-kura raksasa yang memengaruhi dua proto-onkogen diduga — MYCN dan SET. Khususnya, kompleks SET memediasi respons stres oksidatif yang disebabkan oleh kerusakan mitokondria melalui aksi PRF1 dan GZMA dalam sitotoksik limfosit T sitotoksik- dan sitotoksisitas yang dimediasi oleh pembunuh alami33. Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa beberapa perubahan jumlah salinan gen mungkin telah mempengaruhi mekanisme pertumbuhan tumor spontan. Namun demikian, studi lebih lanjut diperlukan untuk mengevaluasi faktor penentu genom dari mekanisme kanker spesifik-kura-kura diduga.

Akhirnya, kami memilih, untuk anotasi yang diawasi secara manual, satu set 500 gen yang mungkin terlibat dalam modulasi penuaan (Bagian Tambahan 7 dan Tabel Tambahan 15). Umur panjang yang ekstrim dari kura-kura raksasa diperkirakan melibatkan banyak gen yang mempengaruhi ciri khas usia yang berbeda11. Kami menemukan beberapa perubahan dalam genom kura-kura raksasa yang mungkin memainkan peran langsung di dalamnya, dan merusak tanda penuaan dan proses penuaan lainnya, seperti perkembangan kanker34 (Gbr. 2b). Pertama, kami mengidentifikasi perubahan dalam tiga faktor kandidat (NEIL1, RMI2 dan XRCC6) yang terkait dengan pemeliharaan integritas genom, ciri utama usia11 (Gambar 3a). Dengan demikian, kami menemukan dan memvalidasi duplikasi yang mempengaruhi NEIL1, protein utama yang terlibat dalam proses perbaikan eksisi-dasar yang ekspresinya telah dikaitkan dengan rentang hidup yang panjang di beberapa spesies35. Demikian juga, RMI2 diduplikasi dalam kura-kura, menunjukkan kemampuan yang ditingkatkan untuk menyelesaikan perantara rekombinasi homolog untuk membatasi pembentukan crossover DNA dalam sel36. Dalam eksplorasi awal hipotesis ini, kami mengekspres berlebihan NEIL1 dan RMI2 dalam sel HEK-293T dan mengekspos sel yang terinfeksi dengan dosis H2O2 atau sinar ultraviolet sublethal, memantau kerusakan DNA dengan analisis western blot pada 24 dan 48 jam setelah pengobatan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. 22, 32 dan 33, ekspresi kedua gen menghasilkan penurunan kadar histon H2AX terfosforilasi dan polyase (ADP-ribosa) polimerase terpecah (PARP), menunjukkan penurunan tingkat kerusakan DNA37. Pada gilirannya, hasil ini konsisten dengan hipotesis bahwa tingkat NEIL1 dan RMI2 dapat mengatur kekuatan mekanisme perbaikan DNA. Juga dalam kaitannya dengan mekanisme perbaikan DNA, kami mengidentifikasi dan memvalidasi varian yang mempengaruhi XRCC6 — menyandikan helicase yang terlibat dalam gabungan non-homolog dari double-strand DNA break — yang dapat memengaruhi situs penjumlahan yang diketahui (p.K556R). Lisin ini dilestarikan dalam vertebrata yang beragam tetapi, terutama, diubah dalam kura-kura raksasa, dan juga pada tikus mol telanjang (p.K556N), hewan pengerat yang berumur panjang, yang menunjukkan proses evolusi evolusi konvergen (Gambar 3b). Karena sumoylasi diinduksi setelah kerusakan DNA dan memainkan peran kunci dalam respons perbaikan DNA dan berbagai proses pengaturan38, varian ini dapat mencerminkan tekanan selektif yang bekerja pada regulasi perbaikan jeda DNA untai ganda pada organisme yang berumur panjang (Bagian Tambahan 5.5) .

Mengenai gesekan telomer - ciri utama lain dari usia11 - kami menemukan dalam kura-kura raksasa satu varian dalam DCLRE1B (hal. R498C) yang berpotensi mempengaruhi antarmuka pengikatannya dengan faktor pengulangan pengulangan telomerik 2 (TERF2) (Gbr. 3b dan Bagian Tambahan 7.2). Perubahan ini, bersama dengan varian yang disebutkan sebelumnya yang memengaruhi gen perbaikan DNA yang mungkin juga berdampak pada dinamika telomer 39,40,41, menyoroti relevansi pemeliharaan telomer sebagai mekanisme pengaturan umur panjang dalam kura-kura. Selain itu, kami menemukan perubahan yang berpotensi mempengaruhi proteostasis (Gambar 2a). Kami secara independen menemukan ekspansi spesifik gen faktor pemanjangan EEF1A1 di C. abingdonii, A. gigantea dan G. agassizii, seperti yang dijelaskan dengan anotasi otomatis. Yang penting, ekspresi berlebih dari homolog EEF1A1 di Drosophila melanogaster telah dikaitkan dengan peningkatan umur pada spesies ini42.

Seiring waktu, deregulasi pengindraan gizi — ciri khas lain dari penuaan — dapat diakibatkan oleh perubahan mekanisme kontrol metabolik dan jalur pensinyalan12. Varian tersebut mempengaruhi loop aktivasi GSK3A (Bagian Tambahan 4.1), yang hadir dalam C. abingdonii dan semua kura-kura yang diuji dari Kepulauan Galapagos dan Aldabra Atoll, serta outgroup kontinental mereka, G. agassizii dan C. picta bellii, mungkin terlibat dalam pemeliharaan glukosa homoeostasis. Menariknya, penghambatan GSK3 dapat memperpanjang umur di D. melanogaster43. Demikian juga, perubahan yang teridentifikasi pada gen kura-kura raksasa lainnya yang terlibat dalam metabolisme glukosa, seperti inaktivasi NLN yang disebutkan sebelumnya, dapat memberikan kandidat yang menarik untuk mempelajari penginderaan nutrisi pada spesies yang berumur panjang ini (Bagian Tambahan 7.4).

Mengenai fungsi mitokondria, kami menemukan dua varian (p.Q366M dan p.M487T) yang berpotensi mempengaruhi fungsi ALDH2, dehidrogenase aldehida mitokondria yang terlibat dalam metabolisme alkohol dan peroksidasi lipid, di antara proses detoksifikasi lainnya44. Khususnya, varian p.Q366M, yang dapat mengubah situs pengikatan NAD dari ALDH2, secara eksklusif ditemukan di kura-kura raksasa Galapagos, tetapi tidak di kerabat dekat benua mereka, Chelonoidis chilensis, atau di Aldabra atau Agassiz yang lebih dekat. Dengan demikian, perubahan-perubahan ini juga dapat mengubah proses detoksifikasi dan berkontribusi pada mekanisme pro-umur panjang. Bersama-sama dengan perubahan spesifik yang dijelaskan di atas pada gen lain dari kura-kura raksasa, seperti NLN dan GAPDH, yang menyandikan enzim yang terkait dengan fungsi mitokondria 45,46, varian ini juga dapat mempengaruhi disfungsi mitokondria, ciri antagonistik dari usia11 (Tambahan Bagian 7.5).

Kami juga telah menemukan bukti dalam kura-kura dari beberapa varian yang berkaitan dengan perubahan komunikasi antar sel (Tambahan Bagian 7.6 dan Tambahan Gambar. 30), suatu ciri integratif usia11. Dengan demikian, kami telah mendeteksi secara eksklusif pada C. abingdonii, kodon penghentian prematur yang mempengaruhi ITGA1 (hal. R990 *), suatu integrin penting yang terlibat dalam interaksi sel-matriks dan sel-sel. Selain itu, varian tersebut mempengaruhi MIF juga diharapkan menyebabkan pembentukan ikatan disulfida antar-rantai yang tidak aktif, menghambat kaskade pensinyalan intraseluler47. Selain itu, defisiensi MIF mengurangi peradangan kronis pada jaringan adiposa putih dan memperpanjang umur, terutama sebagai respons terhadap pembatasan kalori48,49. Akhirnya, kami telah mencatat varian spesifik dalam IGF1R yang diharapkan akan mempengaruhi interaksi antara reseptor ini dan faktor pertumbuhan IGF1 / 250. Khususnya, model homologi wilayah ini dalam IGF1R di C. abingdonii menunjukkan bahwa posisi 724 terletak di permukaan protein, dan adanya residu asam aspartat mengubah medan elektrostatik lokal (Gambar 4a). Umur yang diperpanjang pada spesies yang berbeda berkorelasi dengan penurunan sinyal IGF, 51,52, yang menunjukkan bahwa perubahan unik dalam IGF1R ini dapat memberikan target yang menarik untuk mempelajari mekanisme seluler yang mendasari masa hidup yang luar biasa dari hewan-hewan ini. Untuk mengeksplorasi konsekuensi fungsional dari pensinyalan IGF1 diferensial yang disebabkan oleh varian p.N724D yang ditemukan dalam reseptor IGF1 (IGF1R), kami menginfeksi sel HEK-293T dengan pCDH, pCDH-IGF1RWT dan pCDH-IGF1RN724D. Sel yang mengekspresikan reseptor mutan menunjukkan pelemahan pensinyalan IGF1, dibandingkan dengan yang mengekspresikan protein tipe liar, diukur sebagai penurunan signifikan dalam tingkat fosforilasi IGF1R pada 5 menit (interval kepercayaan 95% perbedaan: 0,1119-1,5330, t = 2,454, P = 0,026) dan 10 menit (interval kepercayaan 95% perbedaan: 0,1991-1,6200, t = 2,714, P = 0,0153) setelah pengobatan IGF1 (Gbr. 4b, Bagian Tambahan 7.6.2 dan Tambahan Gambar. 31). Menurut analisis varian dua arah, bentuk IGF1R eksogen menyumbang 16,07% dari total variasi (F1,4 = 20,91, P = 0,0102), sementara waktu menyumbang 44,23% dari total variasi (F3,12 = 6,57, P = 0,0071). Menariknya, kami juga menemukan dalam penghapusan kura-kura di daerah pengkodean IGF2R yang mengakibatkan hilangnya dua asam amino. Fakta bahwa varian IGF2R telah dikaitkan dengan umur panjang manusia53 membuka kemungkinan bahwa varian yang ditemukan pada kura-kura juga dapat berkontribusi untuk meningkatkan umur hewan yang berumur panjang ini.

Singkatnya, dalam karya ini, kami melaporkan karakterisasi awal genom kura-kura raksasa. Kami melengkapi anotasi otomatis genom dari dua spesies kura-kura raksasa dengan strategi berbasis hipotesis dengan menggunakan anotasi yang diawasi secara manual dari sejumlah besar gen. Analisis dari sekuens yang dihasilkan menawarkan kandidat gen dan jalur yang dapat mendasari karakteristik luar biasa dari spesies ikonik ini, termasuk perkembangannya, gigantisme dan umur panjang. Pemahaman yang lebih baik tentang proses yang telah kami pelajari dapat membantu untuk lebih jauh menjelaskan biologi spesies ini dan karena itu membantu upaya berkelanjutan untuk melestarikan garis keturunan yang semakin menyusut ini. George Lonesome — perwakilan terakhir C. abingdonii, dan lambang terkenal dari keadaan spesies yang terancam punah — meninggalkan warisan termasuk kisah yang ditulis dalam genomnya yang pembukaannya baru saja dimulai.

Metode

Urutan dan perakitan genom

Kami memperoleh DNA dari sampel darah dari Lonesome George — anggota terakhir C. abingdonii. DNA ini diurutkan, menggunakan platform Illumina HiSeq 2000, dari pustaka berpasangan berpasangan 180 pasangan basa, pustaka pasangan pasangan insert 5-kilobase (kb), dan pustaka pasangan pasangan 20-kb-insert. Perpustakaan-perpustakaan ini dirakit dengan algoritma AllPaths54 untuk draft genome yang berisi 64.657 contigs dengan N50 dari 74 kb. Kemudian, kami merancah contig dengan SSPACE versi 3.0 (ref. 55) menggunakan pustaka pasangan-penyisipan panjang. Akhirnya, kami mengisi celah dengan PBJelly versi 15.8.24 (ref. 56) menggunakan bacaan yang diperoleh dari 18 sel BioPac. Langkah ini menghasilkan 10.623 perancah dengan N50 dari 1,27 megabase, untuk perakitan akhir 2,3 gigabase. Kemudian, kami mengulangi daerah yang di-soft mask menggunakan RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org) dengan database yang berisi elemen berulang chordate (termasuk dalam perangkat lunak) sebagai referensi. Selain itu, kami menilai kelengkapan perakitan dengan perkiraan kadar gen mereka, menggunakan Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs (BUSCO versi 3.0.0) 57, yang menguji status satu set 2.586 gen vertebrata dari katalog komprehensif orthologues58. Kami juga melakukan RNA-Seq dari darah C. abingdonii dan A. gigantea granuloma, dan menyelaraskan bacaan yang dihasilkan dengan genom yang dikumpulkan menggunakan TopHat59 (versi 2.0.14). Akhirnya, kami memperoleh data seluruh genom dari A. gigantea dengan satu lajur Illumina dari perpustakaan pasangan berpasangan 180-basa. Bacaan yang dihasilkan selaras dengan genom C. abingdonii dengan BWA60 (versi 0.7.5a). Bacaan mentah dari C. abingdonii juga diselaraskan dengan genom untuk kurasi hasil secara manual. Semua pekerjaan pada sampel lapangan dilakukan di Universitas Yale di bawah nomor izin Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional 2016-10825, Izin Taman Galapagos PC-75-16 dan Konvensi Perdagangan Internasional Spesies Terancam Punah nomor 15US209142 / 9.

Anotasi genom

Menggunakan rakitan genom C. abingdonii dan RNA-Seq yang dibaca dari C. abingdonii dan A. gigantea, kami melakukan anotasi de novo dengan MAKER2. Algoritma ini juga diberi makan urutan referensi manusia dan P. sinensis, dan melakukan dua menjalankan dalam mesin virtual Microsoft Azure (Tabel Tambahan 16). Secara paralel, kami menggunakan gen yang dipilih dari database protein manusia di Ensembl sebagai referensi untuk memprediksi secara manual homolog yang sesuai dalam genom C. abingdonii menggunakan algoritma BATI (Blast, Annotate, Tune, Iterate) 61. Secara singkat, algoritma ini memungkinkan pengguna untuk membubuhi keterangan posisi dan batas intron / exon gen dalam genom baru dari hasil tblastn. Selain itu, hasil tblastn terintegrasi untuk mencari homolog baru dalam genom yang dieksplorasi. Data sekuensing telah disimpan di Arsip Baca Sekuens (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), dengan komentar yang menunjukkan wilayah mana yang diisi dengan BioPac yang dibaca dan karenanya mungkin mengandung kesalahan yang sering terjadi.

Perubahan ukuran dan keragaman populasi yang efektif

Kami merekonstruksi perubahan populasi efektif dari waktu ke waktu menggunakan model PSMC5 dengan cara berikut: pembacaan kedua individu diselaraskan dengan rakitan referensi menggunakan bwa mem (versi 0.7.15-r1140). Kami kemudian membangun sekuens pseudodiploid menggunakan panggilan varian yang dihasilkan dengan SAMtools dan BCFtools62, yang membutuhkan basis minimal dan kualitas pemetaan 30. Selain itu kami juga menyamarkan wilayah mana pun dengan cakupan di bawah 36 atau di atas 216 untuk sampel C. abingdonii, dan di bawah 8 atau di atas 52 untuk sampel A. gigantea, sebagai fungsi dari cakupan rata-rata genom masing-masing. Urutan yang dihasilkan digunakan untuk menjalankan 100 replikasi bootstrap PSMC per individu, menggunakan parameter berikut: -N25 -t15 -r5 -p ‘4 + 25 * 2 + 4 + 6’. Hasilnya dirata-rata dan diskalakan ke waktu nyata dengan asumsi tingkat mutasi (μ) 2,5 × 10−8 dan waktu generasi (g) 25 tahun.

Perluasan keluarga gen

Untuk mendeteksi ekspansi keluarga gen, kami menyelaraskan semua protein yang diprediksi berpasangan dari anotasi otomatis ke database UniProt63 protein manusia dan database UniProt protein P. sinensis menggunakan BLAST64 (versi 2.6.011). Kemudian, kami menggunakan skrip Perl in-house untuk mengelompokkan protein-protein ini dalam hubungan satu-ke-satu, satu-ke-banyak dan banyak-ke-banyak. Hanya keberpihakan yang mencakup setidaknya 80% dari protein yang lebih panjang, dan dengan lebih dari 60% identitas, dipertimbangkan. Akhirnya, kami menginterogasi database yang dihasilkan untuk menemukan keluarga dengan ekspansi spesifik C. abingdonii dan mengkurasi hasilnya secara manual. Dengan cara ini, kami membangun rangkaian ortologi yang luas yang mungkin mengandung lebih dari satu urutan per spesies. Set ini merekapitulasi sebagian besar keluarga yang diketahui, meskipun beberapa keluarga ini tampak terbelah berdasarkan kesamaan urutan.

Analisis filogenetik, evolusi dan struktural

Selanjutnya, kami menilai bukti untuk tanda tangan seleksi positif yang mempengaruhi kumpulan gen yang diprediksi. Untuk tujuan ini, kami menggunakan basis data dari manusia (Homo sapiens), tikus (Mus musculus), anjing (Canis lupus familiaris), tokek (Gekko japonicus), kadal anole hijau (A. carolinensis), ular sanca (Python bivittatus), ular garter umum (Thamnophis sirtalis), Habu viper (Trimeresurus mucrosquamatus), budgerigar (Melopsittacus undulatus), zebra finch (Taeniopygia guttata), selebaran (Ficedula albicollis), bebek (Anas platyrhynchos), kalkun (kalkun) ), Kura-kura cangkang lunak Cina (P. sinensis), kura-kura laut hijau (Chelonia mydas) dan kura-kura yang dicat (C. picta bellii) untuk menghasilkan perataan berpasangan dari semua gen yang tersedia satu per satu. Untuk tujuan ini, kami menggunakan skrip Perl in-house BLAST dan sederhana (https://github.com/vqf/LG), yang memungkinkan kami untuk mengelompokkan gen berdasarkan identitas (hanya berfokus pada gen yang menyajikan ortologi satu-ke-satu) . Kami kemudian membuang kelompok-kelompok di mana ada lebih dari tiga spesies yang hilang (selalu mengecualikan yang tidak ada C. abingdonii). Dengan cara ini, kami memperoleh 1.592 kelompok urutan (mirip dengan penelitian lain). Kami kemudian menyelaraskannya dengan PRANK versi 150803 menggunakan model kodon dan menganalisis perataan dengan codeml dari paket PAML65. Untuk mencari gen dengan tanda tangan seleksi positif yang memengaruhi gen spesifik untuk C. abingdonii, kami mengeksekusi dua model cabang yang berbeda — M0, dengan nilai ω0 tunggal (di mana ω mewakili rasio penggantian yang tidak identik dan bersinonim) untuk semua cabang ( bersarang), dan M2a, dengan nilai eg2 latar depan eksklusif untuk C. abingdonii dan nilai latar belakang ω1 untuk semua cabang lainnya. Sebagai kontrol, model kedua diulang menggunakan P. sinensis sebagai cabang foreground. Gen-gen dengan nilai ω2 tinggi (> 1) dan nilai ω1 rendah (ω1 <0,2 dan ω1 ~ ω0) di C. abingdonii, tetapi tidak dalam P. sinensis (Bagian Tambahan 1.2 dan Tabel Tambahan 5 dan 17), kemudian dipertimbangkan berada di bawah seleksi positif. Setelah ini, kami menggunakan model M8 untuk menilai kepentingan individu dari setiap situs dalam gen yang dipilih secara positif ini, memperoleh daftar situs yang memiliki minat khusus dalam efek evolusi ini. Hasil ini dibandingkan dengan kura-kura Aldabra melalui keberpihakan, untuk mengevaluasi mana dari residu penting yang diubah (Tabel Tambahan 18). Model homologi dilakukan dengan SWISS-MODEL66 dari templat terdekat yang tersedia. Hasilnya diperiksa dan diterjemahkan dengan DeepView versi 4.0.1. Potensi listrik dihitung dengan DeepView menggunakan metode perhitungan Poisson-Boltzmann. Angka dihasilkan dengan PovRay.

Analisis fungsional

Sel HEK-293T terinfeksi dengan pCDH, pCDH-NEIL1, pCDH-RMI2 atau pCDH-NEIL1 + pCDH-RMI2 dalam kasus studi perbaikan, dan pCDH, pCDH-IGF1RWT atau pCDH-IGF1RN724D dalam kasus analisis IGF1R. Untuk studi perbaikan, kami mengisolasi klon sel HEK-293T yang terinfeksi dengan tingkat ekspresi NEIL1 dan RMI2 yang tepat. Sel terpapar sinar ultraviolet (20 J m) 2) atau H2O2 (500 m) 24 dan 48 jam sebelum dilisiskan dalam buffer lisis NP-40 yang mengandung 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA pH 8 dan 1% NP-40, dan ditambah dengan protease inhibitor cocktail (cOmplete, EDTA-free; Roche), serta inhibitor fosfatase (PhosSTOP; Roche / NaF; Merck). Untuk analisis varian IGF1R, sel-sel serum kelaparan selama 14 jam, kemudian diobati dengan 100 nM IGF1 selama 5, 10 dan 20 menit sebelum lisis dalam buffer yang sama. Jumlah protein yang sama dipecahkan oleh 8 sampai 13% natrium dodesil sulfat poliakrilamida gel elektroforesis dan ditransfer ke membran PVDF (GE Healthcare Life Sciences). Membran diblokir selama 1 jam pada suhu kamar dengan TBS-T (0,1% Tween 20) yang mengandung 5% albumin serum sapi. Immunoblotting dilakukan dengan antibodi primer yang diencerkan 1: 500 hingga 1: 1000 dalam TBS-T dan 1% albumin serum sapi dan diinkubasi semalam pada suhu 4 ° C. Antibodi utama yang digunakan adalah: anti-fosfo-Histone H2AX (Ser139) (EMD Millipore; 05-636, klon JBW301, lot 2854120), anti-PARP (Teknologi Pensinyalan Sel; 9542S, kelinci poliklonal, banyak 15), anti-FLAG (Teknologi Sinyal Sel; 2368S, kelinci poliklonal, banyak 12), anti-IGF1R (Abcam; ab182408, klon EPR19322, banyak GR312678-8), anti-IGF1R (p Tyr1161) (Novus Biologicals; NB100-92555, kelinci poliklonal, banyak CJ36131), anti-β-aktin (Sigma-Aldrich, A5441, klon AC-15, lot 014M4759) dan anti-α-tubulin (Sigma-Aldrich, T6074, klon B-5-1-2, banyak 075M4823V). Setelah dicuci dengan TBS-T, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan IRDye 680RD (LI-COR Biosciences; 926-68071, kambing poliklon-anti-kelinci, banyak C41217-03; dan 926-32220, kambing-anti-mouse poliklonal , lot C00727-03) atau IRDye 800CW (LI-COR Biosciences; 926-32211, polyclonal kambing-anti-kelinci, lot C60113-05; dan 926-32210, polyclonal goat-anti-mouse, lot C50316-03) untuk 1 h pada suhu kamar. Pita protein dipindai pada pemindai inframerah Odyssey (LI-COR Biosciences). Intensitas pita dihitung oleh ImageJ dan digunakan untuk menghitung fosfo-IGF1R / IGF1R

rasio dalam kasus uji IGF1R. Dalam setiap ulangan, sel-sel terinfeksi secara independen. Untuk sampel dari perlakuan ultraviolet, Bendera (RMI2) terdeteksi pada sampel yang sama yang digunakan untuk sisa bercak barat yang ditunjukkan pada panel ini, berjalan secara paralel pada bercak identik. Demikian pula, untuk sampel dari perlakuan H2O2, western blots yang ditampilkan dilakukan dengan sampel yang sama dijalankan secara paralel dalam tiga bercak identik (satu untuk PARP dan aktin, yang kedua untuk Bendera (NEIL1 dan RMI2) dan yang ketiga untuk pH2AX). Setiap sampel berisi satu ulangan. Perbandingan statistik terdiri dari analisis varian dua arah yang dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 7.0. Perbedaan dianggap signifikan secara statistik ketika P <0,05. Ukuran efek dinyatakan sebagai jumlah kelompok kuadrat dibagi dengan jumlah total kuadrat (R2). Pada setiap titik waktu, kedua kelompok juga dibandingkan dengan uji perbedaan paling signifikan Fisher (tidak dikoreksi; α = 0,05).

Ringkasan Pelaporan

Informasi lebih lanjut tentang desain penelitian tersedia di Ringkasan Pelaporan Penelitian Alam yang ditautkan dengan artikel ini.